ГЕМАГГЛЮТИНАЦИЯ (греч, haima кровь + лат. agglutinatio склеивание) — феномен склеивания эритроцитов. Гемагглютинация может быть прямой, т. е. происходить за счет непосредственного воздействия тех или иных агентов на эритроциты, и непрямой (пассивной), когда обработанные антигеном (или антителами) эритроциты агглютинируются соответственно иммунной сывороткой (или антигеном).

Прямую Гемагглютинацию могут вызывать антиэритроцитарные сыворотки, экстракты из тканей слюны, сыворотка человека и животных, а также некоторые бактерии (стафилококки, кишечная палочка, брюшнотифозные, паратифозные, дизентерийные микробы) и многие вирусы. Агглютинация эритроцитов нормальными сыворотками делится на изогемагглютинацию, если сыворотка и эритроциты принадлежат особям одного вида, и гетероагглютинацию, когда происходит склеивание чужеродных эритроцитов.

Способность к Г. сыворотка может приобретать при некоторых заболеваниях. Так, напр., сыворотка больных инфекционным мононуклеозом агглютинирует эритроциты барана (см.Пауля-Буннелля реакция).

Большое теоретическое и практическое значение имеет Г., вызываемая вирусами. Ее впервые описали в 1941 г. Херст (G. К. Hirst), Мак-Клилленд и Хейр (L. Mac Clelland, R. Hare). Они установили, что вирус гриппа агглютинирует эритроциты кур, на основании чего была разработана реакция гемагглютинации (РГА). Впоследствии гемагглютинирующие свойства были обнаружены у многих вирусов. С явлением Г. связана также гемадсорбция, т. е. способность клеток, инфицированных нек-рыми гемагглютинирующими вирусами, адсорбировать эритроциты на своей поверхности (см.Гемадсорбция). Способность вирусов вызывать Г. подавляется соответствующими противовирусными сыворотками, что используется в реакции торможения (погашения) гемагглютинации (РТГА).

РГА и РТГА широко используются как при теоретических исследованиях в области вирусологии, так и при диагностике вирусных инфекций для индикации, идентификации и классификации вирусов, а также для выявления противовирусных антител (антигемагглютининов) в сыворотке крови больных. Так, при выделении вирусов гриппа и паротита индикатором является агглютинация куриных эритроцитов аллантоисной и амниотической жидкостью зараженных куриных эмбрионов.

Для целей идентификации используется избирательная способность некоторых вирусов агглютинировать определенный вид эритроцитов. Вирус кори, напр., агглютинирует только эритроциты обезьян, а вирус энцефаломиокардита мышей — эритроциты барана.

У большинства вирусов гемагглютинин (субстрат, ответственный за Г.) является структурным компонентом вириона.

У вирусов, капсид которых одет наружной липопротеиновой оболочкой (вирусы гриппа, парагриппа, большинство арбовирусов), гемагглютинин находится в этой оболочке и структурно связан с так наз. ворсинками. По хим. природе Гемагглютинины этих вирусов являются глико- или липопротеидами. Так, гемагглютинин вируса гриппа представляет собой тетрамер, состоящий из двух пар гликопротеидов с общим мол. весом 150 000. Гемагглютинирующий гликопротеид оболочки арбовирусов группы В имеет мол. вес 50 000.

У вирусов, не имеющих внешней оболочки, гемагглютинин связан со структурами капсида. Так, у аденовирусов гемагглютинирующей активностью обладают фибриллы, выходящие из вершинных капсомеров.

Гемагглютинин оспенных вирусов является липопротеидом и представляет собой один из продуктов их репродукции, но, по-видимому, не включается в состав вириона, поскольку очищенные вирусные частицы Г. не вызывают.

Г. могут обусловливать как инфекционные вирусные частицы, так и инактивированные, поэтому Гемагглютинирующий титр вируса не отражает его инфекционной активности. В ряде случаев гемагглютинин может отделяться от вирусной частицы (напр., у аденовирусов). Некоторые вирусы (гриппа, кори, ECHO) могут в процессе своей репродукции формировать пустые, лишенные РНК вирионы, которые также обладают гемагглютинирующей активностью.

Механизм Г. изучался гл. обр. в опытах с вирусом гриппа. Его взаимодействие с эритроцитами проходит две фазы — адсорбцию и последующуюэлюцию (см.). Первый этап адсорбции вирусов на эритроцитах представляет собой физ. процесс и определяется разностью зарядов и межмолекулярным притяжением (силами Ван-дер-Ваальса). Вторым этапом является хим. взаимодействие вируса с рецепторами эритроцита.

Механизм самого процесса склеивания эритроцитов не совсем ясен. Может иметь значение изменение электростатического заряда эритроцитов после адсорбции на них вирусов.

Возможно также образование вирусными частицами «мостиков» между отдельными эритроцитами.

Местом соединения вируса гриппа и некоторых парамиксовирусов с поверхностью эритроцитов являются рецепторы последнего, представляющие собой дисахарид 6-(N-ацетилнейраминил) альфа-D-N-ацетилгалактозамин. Под действием вирусного фермента нейраминидазы рецепторы эритроцитов расщепляются на N-ацетилгалактозамин и N-аце-тилнейраминовую к-ту.

При t° 37° через несколько часов происходит элюция вируса гриппа с эритроцитов. В гипертоническом р-ре хлорида натрия этот процесс протекает (быстрее. Вследствие разрушения рецепторов эритроциты теряют способность агглютинироваться повторно тем же вирусом, хотя могут склеиваться под действием ряда других вирусов.

Гликопротеидные рецепторы эритроцитов можно разрушить также перйодатом, трипсином и фильтратом холерных вибрионов, содержащим нейраминидазу.

Большинство других вирусов (оспенные, арбовирусы и др.) не разрушает рецепторов эритроцитов. Их элюция происходит не спонтанно, а при воздействии иммунной сыворотки, изменении электролитного состава среды, ее pH и др.

Г. зависит от свойств как вируса, так и эритроцитов (табл.).

ВИРУСЫ, СПОСОБНЫЕ ВЫЗЫВАТЬ АГГЛЮТИНАЦИЮ ЭРИТРОЦИТОВ НЕКОТОРЫХ ПОЗВОНОЧНЫХ

Виды вирусов

Виды

позвоночных

Аденовирусы

3, 7, 11, 14, 16, 20,

21, 25, 28

Обезьяны

8, 9, 10, 13, 15, 17, 19, 22, 23, 24, 26, 27

Белые крысы

Арбовирусы антигенных групп А, В, супергруппы Буньямвера

Гусь

Вирус краснухи

Голубь, гусь

Ортомиксовирусы группа А, В, C

Человек, куры, морская свинка

Оспенные вирусы натуральной оспы, вакцины, оспы обезьян, эктромелии

Определенные особи кур

Парамиксовирусы

паротита, ньюкаслской болезни кур

Человек, куры, морская свинка

парагриппа НА-1, НА-2, НА-3

Человек, куры, морская свинка

кори

Обезьяны

Полиомавирусы полиомы мышей и вирус К

Морские свинки

Рабдовирусы бешенства, везикулярного стоматита

Гусь

Реовирусы

Человек

Энтеровирусы ECHO 3, 6, 7, 11, 12, 15, 19, 20, 21, 24, 25, 29, 30, 33

Человек

Коксаки

А-20, А-21, А-24

Человек

А-7

Определенные особи кур

B-1, B-З, В-5, В-6

Человек

энцефаломиелита мышей GD VII

Человек

энцефаломиокардита

Баран

Гемагглютинирующая активность различна как у членов одной классификационной группы, так и у разных штаммов одного вируса и даже у отдельных клонов одного штамма. Напр., штаммовые различия выражены у энтеровирусов некоторых серотипов. В популяции вируса Коксаки А-21 были обнаружены как гемагглютинирующие частицы, так и лишенные этого свойства.

Для получения видимой Г. вирусная суспензия должна содержать не менее 105—106 вирусных частиц в 1 мл.

Гемагглютинирующую активность некоторых вирусов (напр., кори, паротита, краснухи) можно повысить путем обработки вирусной взвеси твином-80 и эфиром, вероятно, вследствие дезинтеграции наружной оболочки вируса.

Г. зависит также от среды культивирования вируса и от наличия ингибиторов, блокирующих этот процесс.

Напр., при культивировании вируса Коксаки А-21 в перевиваемых клетках злокачественного происхождения продуцируются только негемагглютинирующие частицы. Источником получения гемагглютинирующих антигенов арбовирусов является гл. обр. мозг зараженных мышей-сосунков, содержащих много ингибиторов Г. Поэтому для приготовления этих антигенов применяют экстракцию мозговой ткани боратно-солевым р-ром с pH 9,0, очистку фреоном, преципитацию ацетоном.

Разблокировки гемагглютинина с большой эффективностью можно добиться также путем дополнительной обработки взвеси твином-80 и эфиром, ультразвуком и трипсином в малой концентрации.

У некоторых вирусов способность вызывать Г. зависит от числа пассажей в том или ином субстрате. Здесь играет роль адаптация вируса к условиям культивирования и повышения активности его репродукции до уровня, когда концентрация вирусных частиц становится достаточной для появления Г. Иногда наблюдается обратная зависимость: с числом пассажей Гемагглютинирующая активность вируса уменьшается вплоть до полного исчезновения. Возможно, в основе этих явлений лежит селекция (во время пассажей) гемагглютинирующих или негемагглютинирующих частиц.

Из числа факторов, характеризующих эритроциты, особое значение имеет их видовая принадлежность.

Способность эритроцитов агглютинироваться тем или иным вирусом устанавливается эмпирически. Обычно вирусы, относящиеся к одной классификационной группе, агглютинируют одни и те же виды эритроцитов. Вместе с тем имеют значение и индивидуальные свойства донора.

Влияет на Г. также возраст и пол донора. Напр., вирус осповакцины более активно агглютинирует эритроциты взрослых кур, чем цыплят.

Для работы с арбовирусами предпочтительны эритроциты молодых птиц. Кроме того, рекомендуется использовать эритроциты гусаков, а не гусынь, поскольку гормональные сдвиги в период яйцекладки и высиживания яиц меняют свойства поверхности эритроцитов, в результате чего у них может появиться рефрактерность к действию вируса или склонность к спонтанной агглютинации.

Эритроциты некоторых видов животных (кроликов, крыс, мышей) нередко дают спонтанную агглютинацию, что необходимо учитывать при разработке стандартных условий Г. с каждым вирусом. Эритроциты птиц предпочтительнее эритроцитов млекопитающих, поскольку они быстро оседают, дают четкую картину и мало подвержены спонтанной агглютинации. При постановке РГА с нек-рыми вирусами, напр, вирусом гриппа, могут быть использованы как свежие эритроциты, так и консервированные с помощью 25% формалина.

Г. зависит от электролитного состава среды, концентрации водородных ионов и температуры. В среде без электролитов агглютинации эритроцитов вирусами не происходит.

Существует определенный оптимум электролитного состава среды; напр., адсорбция гемагглютининов вируса осповакцины на куриных эритроцитах является максимальной при 0,45—1,8% хлорида натрия.

Постановка РГА осуществляется при t° 4; 20—25 или 37°. Вирус гриппа, напр., лучше всего агглютинирует эритроциты при t° 4°, вирус осповакцины — при t° 37°, а для Г. арбовирусами температура не имеет значения.

Требования разных вирусов к концентрации водородных ионов также неодинаковы. Большинство из них вызывает Г. при pH 6,0—8,5. Поэтому в качестве среды чаще всего используют изотонический р-р хлорида натрия, к к-рому иногда прибавляют 0,014 М фосфатный буфер с pH 7,2 (при Г. с вирусами гриппа, кори, осповакцины и др.).

Арбовирусы, способность которых к Г. очень слабая, требуют строго определенной концентрации во дородны х ионов: отклонение от pH, оптимального для каждого вируса, допускается не более, чем на 0,3— 0,4 ед.

Поскольку Гемагглютинины этих вирусов стабильны лишь в щелочной среде (при pH 9,0), а оптимальной для постановки РГА является зона с pH 5,6—7,0, необходимую концентрацию водородных ионов создают в момент соединения антигена с эритроцитами, добавляя к щелочной взвеси вируса находящиеся в кислом буферном р-ре эритроциты.

Состав буферных р-ров может влиять на видовой спектр чувствительности эритроцитов. Если, напр., в среде обычного состава вирус краснухи агглютинирует эритроциты цыплят, голубей и гусей, то при использовании 0,025 М HEPES-бу-фера (N-2-hydroxyethylpiperazine — N12-ethanesulfouic acid) pH 6,2 с прибавлением 0,4 М NaCl, 0,001 М CaCl2, 1% альбумина сыворотки крупного рогатого скота и 0,00025% желатины он агглютинирует также эритроциты взрослых кур, человека (кровь 0 группы), обезьян, овец, свиней, кошек, кроликов, крыс, хомячков и мышей.

Для подтверждения специфичности вирусной Г., а также для выявления в сыворотках вирусных антигемагглютининов при серол, исследованиях служит РТГА. Специфичность ее не одинакова для разных групп вирусов. Для арбовирусов рода альфа- и флавивирусов РТГА, является группоспецифической, т. е. выявляет антигенные связи между членами данной группы. Это затрудняет оценку результатов серол, исследований при существовании в какой-либо местности нескольких вирусов одной группы. У адено- и реовирусов с помощью РТГА выявляются типоспецифические особенности, а у вирусов гриппа улавливаются даже тонкие различия между штаммами одного вида.

Для РТГА желательно использовать высокоактивные антигены. Антигены с низкой активностью нередко содержат много негемагглютинирующих вирусных частиц, которые могут соединяться с антителами и препятствовать их выявлению. При использовании в качестве источника гемагглютинина инфицированных клеточных культур из состава среды исключают сыворотку или предварительно удаляют из нее ингибиторы Г.

Блокирующие Г. сывороточные ингибиторы по хим. составу являются в основном бета-липопротеидами, а по размеру молекул близки к 198-антителам . Сыворотки, исследуемые в РТГА, освобождают от ингибиторов путем нагревания при t° 56 или 62° в течение 30 мин., обработки фильтратом холерных вибрионов или нейраминидазой, трипсином, адсорбции ингибиторов каолином, преципитации антител ацетоном, обработки хлоридом магния и гепарином, обработки сульфатным декстраном и хлоридом кальция, обработки риванолом. Эффективность отдельных методов в отношении удаления различных ингибиторов неодинакова. Первые три метода достаточны для удаления ингибиторов Г., вызываемой вирусами гриппа и парагриппа. Обработку сывороток каолином и ацетоном используют при работе с арбовирусами, риванолом, при изучении энтеровирусных инфекций. При выявлении антител к вирусу краснухи применяют обработку каолином, хлоридом магния и гепарином или сульфатом декстрана и хлоридом кальция.

Исследуемые в РТГА сыворотки освобождают также от агглютининов того вида эритроцитов, который используется при постановке-реакции. Это осуществляется путем адсорбции агглютининов концентрированной взвесью этих эритроцитов.

Техника постановки РГА и РТГА

Реакции ставят в пробирках или на пластинах из органического стекла с углублениями. Широкое применение находит микрометод с использованием микротитра-тора Такачи, который представляет собой набор небольших пластин с U-образными углублениями, комплект капельниц и дилюторов. Объем реакционной смеси при макрометоде составляет 0,8 мл, а при микрометоде — 0,1 мл. Эритроциты используют в концентрации от 0,25 до 1%.» Для постановки РГА соединяют 0,2 (0,025) мл антигена, 0,2 (0,025) мл солевого р-ра и 0,4 (0,05) мл взвеси эритроцитов. В РТГА сохраняются те же соотношения ингредиентов, но вместо солевого р-ра вносится исследуемая сыворотка. В РГА определяют титр гемагглютинина, т. е. наибольшее разведение, к-рое дает четкую Г. Количество гемагглютинина, содержащееся в 0,2 мл этого разведения, будет составлять одну гемагглютинирующую единицу (ГЕ). Для титрования сывороток в РТГА в зависимости от особенностей вируса используют 4—8 агглютинирующих единиц (АЕ).

Схема реакции гемагглютинации для обнаружения и титрования вируса в зараженных культурах и реакции торможения гемагглютинации для титрования иммунных сывороток по их способности предотвращать гемагглютинации), вызываемую вирусом (на примере вируса гриппа). В верхнем ряду рисунка — титрование гемагглютинина. Определяют рабочую дозу гемагглютинина, которая должна составлять 4 гемагглютинирующие единицы (ТЕ) и соответствует разведению вируса 1 : 40; одна Г E соответствует разведению 1 : 160 (максимальное разведение вирусов, способное вызвать гемагглютинацию). В нижнем ряду рисунка — титрование сыворотки с 4 Г E гемагглютинина. Гемагглютинин в дозе 4 Г E при соединении с сывороткой до разведения 1 : 160 не вызывает агглютинацию эритроцитов (торможение реакции). Меньшие количества сыворотки (разведение 1 : 320 и выше) агглютинации не препятствуют. Агглютинированные эритроциты образуют осадок на дне пробирки (мелкие точки), неагглютинированные эритроциты выглядят в виде компактного диска (черный кружок).

Результаты реакции, т.е. наличие или отсутствие Г., оценивают по характеру осадка эритроцитов (рис.). Агглютинированные эритроциты оседают в виде пленки, иногда с неровными краями, что напоминает опрокинутый зонтик. При отсутствии агглютинации эритроциты скапливаются в центре углубления в виде компактного диска. Время, необходимое для оседания эритроцитов, варьирует от 45 мин. до 2 час. в зависимости от видовой принадлежности эритроцитов, объема реакционной смеси и температуры. Быстрее оседают «тяжелые», содержащие ядра эритроциты птиц. При более высокой температуре Г. происходит быстрее, чем при более низкой.

Реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации (РНГА или РПГА) имеет две основные разновидности: а) агглютинация эритроцитов, сенсибилизированных антигеном, иммунной сывороткой; б) агглютинация сенсибилизированных антителами эритроцитов в присутствии антигена. Различают две фазы реакции. Во время первой происходит изменение поверхностных свойств эритроцитов в результате адсорбции на них антигенов (или антител). Во второй фазе на сенсибилизированных эритроцитах адсорбируются антитела (или антигены) и происходит образование конгломератов.

Для диагностических целей с бактериальными антигенами РНГА была использована А. Т. Кравченко и М. И. Соколовым в 1946 г. В щелочной среде из бактериальных клеток извлекали полисахаридный антиген, адсорбировали на эритроцитах человека группы 0 и тотчас соединяли с диагностической сывороткой. Метод не требует выделения чистых культур бактерий, т. к. адсорбцию антигена можно проводить непосредственно из патол, материала. С помощью этой методики удавалось обнаружить такое количество антигена в 1 мл солевого р-ра, к-рое соответствует 50—100 млн. микробных тел, определяемых по оптическому стандарту.

РНГА по Кравченко и Соколову и ее модификации нашли применение в бактериологии, но возможности ее были ограничены тем, что на нативных эритроцитах можно адсорбировать лишь полисахаридные антигены, а не белки. Но в 1951 г. Бойден (S. V. Boyden) показал, что эритроциты, протравленные таниновой к-той, приобретают способность адсорбировать на своей поверхности и белки (см.Бойдена реакция).

В 1956 г. Рыцай (Т. Rycaj) модифицировал методику Бойдена: эритроциты сенсибилизируют антителами и используют для обнаружения различных антигенов. Для адсорбции на эритроцитах используют иммуноглобулин иммунных сывороток. РНГА по Рыцаю можно применять не только для индикации антигенов, но и для титрования сывороток, используя феномен гашения, или торможения, РНГА. В этом случае исследуемую сыворотку в соответствующих разведениях соединяют с антигеном, против к-рого предполагают обнаружить антитела, а потом добавляют сенсибилизированные эритроциты. При наличии антител антиген связывается ими и агглютинации не происходит. При исследовании сывороток как по оригинальной методике Бойдена, так и по Рыцаю из сыворотки предварительно следует удалить ингибиторы и гетерогемагглютинины.

Механизм РНГА изучен недостаточно; в связи с этим при подборе условий сенсибилизации эритроцитов разными антигенами и антителами, а также при выборе вида эритроцитов используется в основном эмпирический подход.

Адсорбционная активность нативных эритроцитов невелика, но ее удается повысить, обрабатывая эритроциты танином, акролеином, глутаровым альдегидом, бидиазотированными соединениями (агрегат-гемагглютинация).

Для создания стабильных препаратов ведутся разработки методов хим. присоединения антигена или антител к эритроцитам, в частности путем создания диазосвязей. С этой целью используют, напр., диазотированный бензидин, толулен-2,4-диизоцианат, растворимый в воде карбодимид, дифтородинитробензен. Описано использование борфторида 4,4-бис-дифенилдиазония для присоединения поликонденсированных антител к эритроцитам барана для индикации возбудителей клещевых риккетсиозов.

РНГА широко применяется в бактериологии. При чуме, холере, бруцеллезе и туляремии используют обе разновидности реакции, при скарлатине, дифтерии и дизентерии— только антигенный вариант, для обнаружения ботулинического токсина служат эритроциты, сенсибилизированные антителами.

В вирусол. исследованиях РНГА впервые была проведена с вирусами паротита и ньюкаслской болезни в 1946—1948 гг., затем после почти десятилетнего перерыва последовали сообщения о воспроизведении этой реакции с аденовирусами, вирусом герпеса, миксовирусами, вирусом осповакцины, арбовирусами, цитомегаловирусами, вирусом ящура, лейкозов кур и др. Оптимальные условия реакции для разных вирусов подбирают индивидуально.

Для выявления вируса клещевого энцефалита описана реакция в модификации Рыцая. Эритроциты, сенсибилизированные иммуноглобулином из сыворотки лошади, иммунной к клещевому энцефалиту, используют для индикации вирусов клещевого и шотландского энцефалита в культуре ВНК-21. Для этого вируссодержащую жидкость разводят в 1 % р-ре нормальной лошадиной сыворотки с коэффициентом 2. К 0,5 мл антигена каждого разведения добавляют 1—2 капли сенсибилизированных эритроцитов. Реакцию учитывают через 1—2 часа. Может быть применена РНГА для выявления вируса осповакцины и натуральной оспы как в лабораторных культурах, так и в патол, материале от больных (детрите и корках).

См. такжеАгглютинация,Вирусологические исследования.

Библиография: Гайдамович С. Я. и Казале Дж. Сравнительное изучение гемагглютинирующих арбовирусных антигенов, приготовленных из тканевых культур и из мозга мышей, Вопр, вирусол., № 2, с. 238, 1968; Леви М. И. и Басова H. Н. Эритроцитарные диагностикумы и их применение в серологии, Пробл. особо-опасных инфекц., в. 2, с. 207, Саратов, 1970; Носков Ф. С. и др. Применение реакции непрямой гемагглютинации для лабораторной диагностики натуральной оспы, Вопр, вирусол., № 3, с. 347, 1972;

Ремезов П. И., Голубев Д. Б. и Синицын В. А. Реакция гемагглютинации, Л., 1964, библиогр.;

Рыцай Т. Обнаружение ботулинического токсина типа А в пищевых продуктах методом специфической гемагглютинации, Бюлл. Польск., акад. наук, т. 4, JsTs 9, с. 341, 1956.

^

Источник: Большая Медицинская Энциклопедия (БМЭ), под редакцией Петровского Б.В., 3-е изданиеразбор матрица судьбы